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細胞劃痕實驗是一種簡單且經(jīng)濟的體外細胞實驗方法，主要用于評估細胞在二維空間中的水平遷移能力。它的基本原理是：在細胞單層上人為制造一道“劃痕"，然后觀察細胞如何遷移以“修復"這一劃痕，從而判斷細胞的遷移能力。這一過程不僅與胚胎發(fā)育過程中器官的形成、機體傷口的愈合過程、免疫應答過程等生理過程緊密相關(guān)，而且在癌癥研究中尤為關(guān)鍵，因為癌細胞的遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，這也是實體瘤患者死亡的主要原因之一[1]。因此，研究細胞的遷移行為、評估細胞的遷移能力意義重大。
本期細胞學堂將詳細分析細胞劃痕實驗的優(yōu)勢和局限性，并深入探討其基本步驟及注意事項，幫助您順利開展實驗。
細胞劃痕實驗的優(yōu)勢與局限性
優(yōu)勢
1
能模擬體內(nèi)細胞遷移過程；
2
保留了細胞外基質(zhì)和胞間連接；
3
可與活細胞成像結(jié)合，實時監(jiān)測細胞遷移過程；
4
操作簡單、成本低，適合大多數(shù)實驗室開展。
局限性
1
相較其他幾種常用檢測細胞遷移的實驗，細胞劃痕實驗中細胞長成單層細胞和劃痕愈合需要較長時間；
2
細胞劃痕實驗常用培養(yǎng)皿、6孔板或12孔板培養(yǎng)細胞，這導致細胞和培養(yǎng)基的使用量較大，對于需要使用難以獲取的原代細胞或昂貴化學試劑的實驗不適用；
3
在細胞劃痕實驗中無法模擬化學梯度，無法替代Boyden小室法等其他具有趨化性檢測能力的實驗方法。
實驗步驟
（1）細胞培養(yǎng)
將細胞培養(yǎng)成一層緊密相連的單層細胞（匯合度90%-100%），確保細胞之間沒有明顯空隙。
（2） 制造“劃痕"
使用移液槍吸頭尖-端在已經(jīng)培養(yǎng)好的細胞單層上沿直線方向輕輕刮劃，形成人工“傷口"，隨后用培養(yǎng)基或PBS清洗掉脫落的細胞，確保劃痕邊緣平整。
Tips
為了保證在不同時間點進行圖像采集時能獲得相同的視野，需事先在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板的底部用極細的記號筆畫線（如圖1）或使用剃須刀片輕輕蝕刻培養(yǎng)容器底部作為參考點的標記。
圖1. 六孔板畫線示意圖
（3）孵育與觀察
將培養(yǎng)器皿放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育一段時間（通常為8-48 h，遷移越快的細胞孵育時間越短），孵育完成后，在顯微鏡下拍攝劃痕區(qū)域的照片。
（4）數(shù)據(jù)分析
通過比較初始劃痕和孵育后劃痕的閉合情況，計算細胞的遷移率。遷移率=（初始距離-最終距離）/初始距離或（初始面積-最終面積）/初始面積。
圖2. 細胞劃痕實驗顯示，暴露于10?μmol/L尼古丁顯著促進癌細胞的遷移[2]
注意事項
細胞密度控制
細胞密度不宜過低或過高。密度過低細胞難以形成單層膜，導致細胞間隙過大，細胞可能會向其他間隙遷移而不向劃痕區(qū)域遷移；密度過大則會導致細胞在劃痕時成塊、成片被劃落，得不到筆直、平滑的劃痕區(qū)域。
劃痕初始寬度一致
確保每個實驗組和對照組的劃痕寬度一致，避免寬度差異引起的實驗誤差。
孵育時間
根據(jù)細胞類型和遷移速度，合理設定孵育時間，確保其在最佳條件下完成劃痕閉合。
邊緣細胞堆積處理
建議在PBS環(huán)境下進行劃痕，并洗滌，可消除劃痕邊緣細胞堆積的現(xiàn)象[3]。
拍攝位置一致
必須在同一位置進行拍攝，保證遷移前后照片的可比性。
增殖抑制處理
實驗前使用絲-裂霉-素或低血清培養(yǎng)基處理，避免細胞增殖影響遷移結(jié)果。
數(shù)據(jù)分析
每個實驗應設置至少三個復孔，建議每個復孔記錄多個視野，確保數(shù)據(jù)的嚴謹性和代表性。
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參考文獻
[1]
Paul CD, Mistriotis P, Konstantopoulos K. Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces [J]. Nature Reviews Cancer. 2017; 17(2):131-140.
[2]
Feng C, Mao W, Yuan C, et al. Nicotine-induced CHRNA5 activation modulates CES1 expression, impacting head and neck squamous cell carcinoma recurrence and metastasis via MEK/ERK pathway [J].Cell Death & Disease. 2024 Oct 29; 15(10):785.
[3]
Vang Mouritzen M, Jenssen H. Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera [J]. Journal of Visualized Experiments Jove. 2018; (138):57691.
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